組織缺氧被認(rèn)為是腎缺血再灌注損傷(IRI)中的重要事件，尤其是在缺血期間和再灌注后的最初幾小時(shí)內(nèi)。然而關(guān)于IRI亞急性期腎氧合的知之甚少。我們采用四種不同方法評(píng)估了大鼠嚴(yán)重腎IRI亞急性期(再灌注后24小時(shí)和5天)組織氧合的時(shí)空變化。研究假設(shè)在雙側(cè)腎缺血1小時(shí)后的24小時(shí)和5天內(nèi)，腎臟處于缺氧狀態(tài)，這是由于腎氧輸送(DO2)和氧消耗(VO2)之間的平衡被破壞所致。在IRI的亞急性期，腎DO2并未顯著降低。相比之下，再灌注后24小時(shí)腎VO2比假手術(shù)組減少了55%，再灌注后5天減少了49%。通過(guò)放射遙測(cè)技術(shù)測(cè)量的內(nèi)髓組織PO2在缺血后24小時(shí)比假手術(shù)組高25±12%(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤)。再灌注后5天，組織PO2與假手術(shù)組大鼠的水平相近。通過(guò)克拉克電極測(cè)量的組織PO2在缺血后24小時(shí)持續(xù)高于假手術(shù)組，但在5天后無(wú)顯著差異。Unisense微電極能夠精確測(cè)量腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)不同深度的PO?值，為研究腎臟氧合的空間分布提供了詳細(xì)信息，驗(yàn)證了腎臟在IRI亞急性期的氧合狀態(tài)，并支持了研究的主要結(jié)論。這種高分辨率的測(cè)量方法使得研究者能夠觀察到腎臟不同區(qū)域在IRI后的氧合變化，揭示了腎臟氧合的異質(zhì)性。這種設(shè)備的高靈敏度和精確性使其成為研究腎臟氧合變化的重要工具。通過(guò)哌莫硝唑加合物免疫組化評(píng)估的細(xì)胞缺氧在這兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)基本不存在，且組織缺氧誘導(dǎo)因子水平在腎缺血后下調(diào)。因此，在這種嚴(yán)重IRI模型中，組織缺氧似乎不是亞急性期的必然事件，可能是由于氧消耗顯著減少所致。未來(lái)的研究應(yīng)進(jìn)一步探討不同程度IRI模型中腎臟氧合的變化，以及這些變化與腎臟損傷和修復(fù)過(guò)程的關(guān)系。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極（Clark電極）被用于測(cè)量腎臟組織氧張力（PO?），以評(píng)估腎臟在缺血再灌注損傷（IRI）后的氧合狀態(tài)。具體是使用了Unisense生產(chǎn)的50微米尖端直徑的Clark電極（型號(hào)OX-50）。大鼠在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行手術(shù)準(zhǔn)備，包括氣管切開(kāi)術(shù)、頸靜脈插管、動(dòng)脈插管等，以確保實(shí)驗(yàn)過(guò)程中動(dòng)物的生理狀態(tài)穩(wěn)定。將電極插入腎臟皮質(zhì)，深度為2毫米，分別在腎臟表面的六個(gè)隨機(jī)位置進(jìn)行測(cè)量。從腎臟皮質(zhì)表面開(kāi)始，以1毫米的增量逐步深入，直到10毫米深度，以評(píng)估腎臟不同深度的PO?變化。測(cè)量過(guò)程中，微電極通過(guò)微操縱器（馬達(dá)控制器）精確控制位置，確保數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。精確測(cè)量了腎臟皮質(zhì)和髓質(zhì)不同深度的PO?值，為研究腎臟氧合的空間分布提供了詳細(xì)信息。通過(guò)測(cè)量腎臟組織PO?，發(fā)現(xiàn)再灌注后24小時(shí)，腎臟內(nèi)髓和皮質(zhì)的PO?顯著高于假缺血組，表明腎臟在IRI后并未出現(xiàn)預(yù)期的缺氧狀態(tài)。這一結(jié)果與放射遙測(cè)法測(cè)量的內(nèi)髓PO?結(jié)果一致，進(jìn)一步驗(yàn)證了腎臟在亞急性期的氧合狀態(tài)。

圖1、腎缺血或假缺血后內(nèi)髓組織PO2的時(shí)間變化。數(shù)值為大鼠接受一小時(shí)假缺血(5只)或雙側(cè)腎缺血(7只)后的平均值SE。手術(shù)前(第1天)和手術(shù)后(第0-5天)記錄組織PO2，以通過(guò)碳糊電極的電流進(jìn)行評(píng)估。電流為每個(gè)24小時(shí)的平均值，并以手術(shù)前一天(第1天)平均值的百分比表示。Ptreatment、Ptime和Ptreatment*time是以治療和時(shí)間為因子的雙向重復(fù)測(cè)量方差分析的結(jié)果。

圖2、通過(guò)克拉克微電極評(píng)估組織PO2。首先將電極插入左腎皮層2毫米處的六個(gè)隨機(jī)位置。A：每只大鼠都進(jìn)行了多次測(cè)量，不同的大鼠用不同的符號(hào)表示。封閉符號(hào)代表腎缺血大鼠(24小時(shí)內(nèi)9只，5天內(nèi)8只)，而開(kāi)放符號(hào)代表假缺血大鼠(24小時(shí)內(nèi)10只，5天內(nèi)7只)。B：每只大鼠皮層組織PO2的測(cè)量值取平均值，并以鼠間平均值SE表示。B中，PTr、PT和PTr*T是以治療(Tr)和時(shí)間(T)為因子的雙向方差分析(ANOVA)的結(jié)果。每對(duì)列上方的P值和誤差條顯示的是學(xué)生非配對(duì)t檢驗(yàn)的結(jié)果，使用Dunn-Sidak校正k=2進(jìn)行保守調(diào)整，以考慮在24小時(shí)和5天進(jìn)行比較的事實(shí)。C和D：缺血或假缺血恢復(fù)后24小時(shí)(C)或5天(D)，將電極從皮層表面以1毫米的增量推進(jìn)到左腎10毫米處，建立組織PO2深度曲線(xiàn)。符號(hào)和誤差條是假缺血(○)或雙側(cè)腎缺血(實(shí)心○)1小時(shí)大鼠的平均值±SE。在C和D中，PD、PTr和PD*Tr是以深度(D)和治療為因子的雙向重復(fù)測(cè)量方差分析的結(jié)果。

圖3、雙側(cè)腎缺血或假缺血恢復(fù)24小時(shí)后腎臟切片的咪唑加合物免疫組化。圖片為每組六個(gè)腎臟皮質(zhì)、外髓質(zhì)和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域的典型圖像。

圖4、雙側(cè)腎缺血或假手術(shù)恢復(fù)5天后腎臟切片的咪唑加合物免疫組化圖。圖片為每組六個(gè)腎臟皮質(zhì)、外髓質(zhì)和內(nèi)髓質(zhì)區(qū)域的典型圖像。

圖5、雙側(cè)腎缺血或假缺血后缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)蛋白的表達(dá)。假缺血(○)或雙側(cè)腎缺血(實(shí)心○)恢復(fù)后24小時(shí)和5天，大鼠左腎皮質(zhì)、外髓質(zhì)和內(nèi)髓質(zhì)組織提取物的HIF-1α(A-C)和HIF-2α(D-F)免疫印跡；每組n=6。G：電泳后凝膠的典型圖像。H：硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移后的典型圖像。

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

在嚴(yán)重腎缺血再灌注損傷（IRI）的亞急性期（再灌注后24小時(shí)和5天），腎臟并未出現(xiàn)明顯的缺氧現(xiàn)象。再灌注后24小時(shí)，腎臟內(nèi)髓和皮質(zhì)的組織PO?顯著高于假缺血組，表明腎臟處于相對(duì)高氧狀態(tài)。再灌注后5天，腎臟組織PO?恢復(fù)到與假缺血組相似的水平，未觀察到持續(xù)的缺氧現(xiàn)象。再灌注后24小時(shí)和5天，腎臟DO?未顯著降低，而VO?顯著減少（24小時(shí)減少55%，5天減少49%）。腎臟病理顯示，再灌注后24小時(shí)，腎小管細(xì)胞脫落和刷狀緣/頂膜破壞明顯；5天后，腎小管擴(kuò)張，提示腎臟在IRI后存在一定的修復(fù)和適應(yīng)過(guò)程。這表明腎臟氧合狀態(tài)的維持可能是由于氧消耗的顯著降低，而非氧輸送的增加。本研究的嚴(yán)重IRI模型中，腎臟在亞急性期并未出現(xiàn)明顯的缺氧現(xiàn)象，這可能與腎臟氧消耗的顯著降低有關(guān)。這一發(fā)現(xiàn)提示腎臟在IRI后的氧合狀態(tài)可能受到多種因素的影響，包括氧輸送和氧消耗的動(dòng)態(tài)平衡。