研究簡(jiǎn)介：吸引殺滅（AK）珠子是生物、微生物殺蟲劑，作為合成土壤殺蟲劑的替代品而開發(fā)。對(duì)于線蟲控制，珠子基于藻酸鈣/淀粉共封裝產(chǎn)生二氧化碳（CO 2）的酵母釀酒酵母H205作為吸引成分，昆蟲病原真菌Metarhizium brunneum CB15-III作為殺滅成分。然而，共培養(yǎng)過程中珠子內(nèi)部的物理化學(xué)過程仍不清楚。本研究論文主要研究了共包封的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和綠僵菌（Metarhizium brunneum）在基于海藻酸鈣的吸引和殺滅（Attract-and-Kill,AK）珠子中的相互作用機(jī)制，為開發(fā)高效、環(huán)保的生物殺蟲劑提供科學(xué)依據(jù)。AK珠子作為一種替代傳統(tǒng)化學(xué)殺蟲劑的生物制劑，利用釀酒酵母產(chǎn)生的二氧化碳吸引害蟲，同時(shí)綠僵菌在珠子表面形成孢子以感染并殺死害蟲，尤其針對(duì)金針蟲等土壤害蟲具有顯著的防控潛力。

研究中，通過微電極技術(shù)測(cè)量了不同配方珠子內(nèi)部的氧氣和pH值變化，發(fā)現(xiàn)共包封的AK珠子在2天內(nèi)就形成了明顯的氧氣梯度，中心區(qū)域出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，表明兩種微生物的代謝活動(dòng)強(qiáng)烈。同時(shí)，AK珠子在3天內(nèi)出現(xiàn)了顯著的酸化現(xiàn)象，pH值下降至3.6，這與二氧化碳的最大生產(chǎn)力和綠僵菌孢子形成率的最大值相吻合，表明酸化可能與微生物的代謝活動(dòng)密切相關(guān)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，降低釀酒酵母的負(fù)荷雖然減少了二氧化碳和孢子的總產(chǎn)量，但特定生產(chǎn)力（每1%酵母負(fù)荷的生產(chǎn)力）顯著增加，這表明在較低的酵母負(fù)荷下，每單位酵母的代謝效率更高。通過調(diào)整釀酒酵母的負(fù)荷量，可以優(yōu)化珠子的配方，提高其在實(shí)際應(yīng)用中的效率和經(jīng)濟(jì)性。

研究結(jié)果表明，綠僵菌和釀酒酵母之間存在復(fù)雜的相互作用，既包括有益的協(xié)同作用，也存在資源競(jìng)爭(zhēng)。這種相互作用對(duì)提高AK珠子的殺蟲效果至關(guān)重要。未來的研究將進(jìn)一步深入探索微生物在共包封系統(tǒng)中的相互作用機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)出更高效、更環(huán)保的生物殺蟲劑配方，以滿足農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的需求。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極被用于測(cè)量共包封的釀酒酵母和綠僵菌在基于海藻酸鈣的吸引和殺滅（珠子內(nèi)部的氧氣和pH值變化。將微珠固定在定制的3天打印樣品架中。使用數(shù)碼顯微鏡目視確定微珠表面，隨后通過手動(dòng)作顯微縱器（Unisense）插入電極。電極插入的距離略高于預(yù)期（20-50μm），然后縮回，以減輕刺穿微珠表面時(shí)在點(diǎn)點(diǎn)位置發(fā)生的壓縮，并避免因在電極尖端前形成偽影和擴(kuò)散屏障而引起的偽氧梯度。26起始深度（-500μm）、最大穿透深度（1200μm）、步長(zhǎng)（100μm）、測(cè)量次數(shù)（3次）、測(cè)量時(shí)間（1 s）和測(cè)量間隔時(shí)間（5 s）在專用分析軟件（SensorTrace Profiling，Unisense）中進(jìn)行管理。該軟件還記錄并可視化了獲得的信號(hào)。測(cè)量分三次重復(fù)進(jìn)行，并按照制造商的建議，在兩次重復(fù)之間用乙醇（96%）、鹽酸（HCl，0.01 m）和水沖洗微電極。珠子內(nèi)部的pH的使用了玻璃pH微電極，電極尖端直徑為100微米。珠子同樣被固定在樣品架上，參考電極插入一個(gè)參考珠子中，兩者通過銅線連接。使用手動(dòng)雙微操縱器同時(shí)插入pH電極和參考電極，測(cè)量從珠子表面到內(nèi)部1600微米的pH值。通過精確測(cè)量珠子內(nèi)部的氧氣和pH值變化，揭示了珠子內(nèi)部的微環(huán)境動(dòng)態(tài)。這些數(shù)據(jù)幫助研究人員理解微生物的代謝活動(dòng)和相互作用，還為優(yōu)化珠子配方、提高殺蟲效果提供了科學(xué)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

測(cè)量結(jié)果顯示，共包封后2天已經(jīng)出現(xiàn)了陡峭的氧梯度，內(nèi)部存在低氧區(qū)。包封釀酒酵母或布倫紐分枝桿菌已經(jīng)將平均pH值分別從5.5降低到4.7和4.6。然而在第3天，共培養(yǎng)導(dǎo)致珠子的時(shí)間強(qiáng)酸化至pH值3.6，這遵循最大CO2生產(chǎn)率并與最大分生孢子速率相吻合。降低酵母載量將總CO2生產(chǎn)率降低到一半，分生孢子產(chǎn)量降低93%，而歸一化為1%酵母載量的特定生產(chǎn)率分別增加了8倍和3倍，第3天是一個(gè)例外。研究表明，M.brunneum和S.cerevisiae之間存在普遍有益的相互作用，但也表明了對(duì)資源的競(jìng)爭(zhēng)。這些發(fā)現(xiàn)將有助于開發(fā)具有最高效率的創(chuàng)新聯(lián)合配方，以節(jié)省施用率和成本。

圖1、通過氧微電極在正面（A）、側(cè)面（B）和背面（C）視圖中用于氧氣測(cè)量的樣品架的描述。在穿刺部位，發(fā)生了珠子的壓縮，特別是對(duì)于不含淀粉的珠子（C），微電極執(zhí)行了進(jìn)/出運(yùn)動(dòng)。

圖2、實(shí)驗(yàn)裝置（A）和用于pH測(cè)量的樣品架在帶有pH微電極和外部參比電極（B）的微珠內(nèi)。測(cè)量珠和參比珠通過連接到樣品架的銅線（B，白色箭頭）電接觸。測(cè)量過程中的視角（C）。

圖3、綠僵菌（MB）和釀酒酵母（SC）的共包封導(dǎo)致海藻酸鈣/淀粉珠（A）內(nèi)的氧分布呈陡峭梯度，并顯著降低總氧水平（B）。在25°C的潮濕濾紙上孵育2天后，使用Clark型氧微電極測(cè)量整個(gè)珠子半徑內(nèi)不同成分的濕珠內(nèi)的氧（平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差，n=3）。氧水平歸一化為珠子表面的氧水平。

圖4、綠僵菌（MB）和釀酒酵母（SC）的共包封導(dǎo)致AK珠中pH值的時(shí)空降低。在25°C濕濾紙上孵育0-16天后，在整個(gè)微珠半徑（0–1600μm）內(nèi)測(cè)量不同成分的濕珠內(nèi)的pH值。

圖5、二氧化碳（CO 2）生產(chǎn)率（A）和分生孢子形成（B）在每個(gè)給定時(shí)間點(diǎn)通過減少藻酸鹽/淀粉珠中與綠僵菌共包埋中的釀酒酵母（酵母）載量而顯著降低。珠子要么在室溫下在通風(fēng)玻璃瓶中的水瓊脂上培養(yǎng)，然后用CO 2計(jì)進(jìn)行測(cè)量，要么在23°C的密封培養(yǎng)皿中孵育，并使用細(xì)胞計(jì)數(shù)室測(cè)定分生孢子濃度。

結(jié)論與展望

吸引殺滅（AK）珠子是生物、微生物殺蟲劑，作為合成土壤殺蟲劑的替代品而開發(fā)。對(duì)于線蟲控制，珠子基于藻酸鈣/淀粉共封裝產(chǎn)生二氧化碳（CO 2）的酵母釀酒酵母H205作為吸引成分，昆蟲病原真菌Metarhizium brunneum CB15-III作為殺滅成分。然而共培養(yǎng)過程中珠子內(nèi)部的物理化學(xué)過程仍不清楚。本研究揭示了用微電極測(cè)量的AK珠子內(nèi)氧氣和pH值的時(shí)空條件，并描述了釀酒酵母對(duì)CO2和分生孢子形成的影響。共包埋的MB和SC存在協(xié)同作用，即使兩種真菌以標(biāo)準(zhǔn)酵母負(fù)荷競(jìng)爭(zhēng)AK珠子中的資源。

Unisense微電極被用于測(cè)量共包封的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和綠僵菌（Metarhizium brunneum）在基于藻酸鈣的吸引和殺滅（Attract-and-Kill,AK）珠子內(nèi)部的氧氣和pH值變化。獲得的數(shù)據(jù)不僅幫助研究人員理解微生物的代謝活動(dòng)和相互作用，還為優(yōu)化珠子配方、提高殺蟲效果提供了科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果表明，M.brunneum和S.cerevisiae之間存在普遍有益的相互作用，但也表明了對(duì)資源的競(jìng)爭(zhēng)。這些發(fā)現(xiàn)將有助于開發(fā)具有最大功效的具有成本效益的生物共制劑，從而促進(jìn)害蟲管理。這些發(fā)現(xiàn)將有助于開發(fā)具有最高效率的創(chuàng)新聯(lián)合配方，以節(jié)省施用率和成本。未來需進(jìn)一步研究微生物之間的相互作用機(jī)制，例如在單細(xì)胞水平上使用微流控培養(yǎng)系統(tǒng)，以更深入地理解這些復(fù)雜的關(guān)系。識(shí)別珠子內(nèi)部的物理化學(xué)限制或協(xié)同作用對(duì)真菌生長(zhǎng)和殺蟲效果的影響，以進(jìn)一步優(yōu)化生物殺蟲劑的配方。