背景介紹：研究了中國濃香型白酒生產(chǎn)過程中發(fā)酵谷物和窖泥（微生物群落之間的協(xié)同作用及其對有機酸合成的影響。濃香型白酒是一種以高粱等淀粉質(zhì)原料為主要成分，通過多物種微生物發(fā)酵制成的蒸餾酒。發(fā)酵過程中，發(fā)酵谷物和窖泥作為微生物生長的兩個關(guān)鍵棲息地，其代謝分工尚不清楚。研究人員通過分析發(fā)酵過程中的環(huán)境變量、關(guān)鍵代謝物和微生物群落的變化，揭示這兩個棲息地微生物群落的協(xié)同作用機制。采用的研究方法包括樣本收集、環(huán)境變量和代謝物含量測定、DNA提取與定量實時PCR（qPCR）、Illumina MiSeq擴增子測序以及功能預(yù)測分析（PICRUSt）。樣本收集自四川瀘州老窖集團的泥窖，發(fā)酵周期為46天。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵谷物和窖泥在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出不同的物理化學(xué)環(huán)境：發(fā)酵谷物呈酸性，乙醇含量高，而窖泥呈中性。乳酸主要在發(fā)酵谷物中積累，丁酸和己酸則主要在窖泥中產(chǎn)生。微生物群落結(jié)構(gòu)分析顯示，細(xì)菌在發(fā)酵過程中占主導(dǎo)地位，且發(fā)酵谷物和窖泥的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有顯著差異。發(fā)酵谷物中的細(xì)菌群落多樣性在發(fā)酵過程中顯著下降，而窖泥中的細(xì)菌群落多樣性相對穩(wěn)定。乳酸菌（Lactobacillus）在發(fā)酵谷物中占主導(dǎo)地位，而窖泥中以梭菌綱（Clostridia）為主，特別是氫孢菌屬（Hydrogenispora）。功能預(yù)測分析表明，參與乙酸和乳酸生物合成的酶主要富集在發(fā)酵谷物樣本中，而窖泥的細(xì)菌群落顯示出更大的丁酸和己酸合成潛力。體外模擬發(fā)酵實驗進一步驗證了Jiupei微生物群落在乙酸和乳酸生產(chǎn)中的作用，以及窖泥微生物群落將這些酸轉(zhuǎn)化為丁酸和己酸的能力。本研究表明，發(fā)酵谷物和窖泥微生物群落之間存在協(xié)同合作，共同推動了濃香型白酒中關(guān)鍵風(fēng)味化合物的形成。這一發(fā)現(xiàn)不僅增進了對濃香型白酒發(fā)酵過程中微生物群落相互作用的理解，而且為通過調(diào)節(jié)微生物群落來改善白酒風(fēng)味和質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。

Unisense微電極系統(tǒng)的應(yīng)用

Unisense微電極系統(tǒng)被用于監(jiān)測發(fā)酵過程中發(fā)酵谷物和窖泥的氧氣含量變化。使用了OX-50型號的微電極傳感器來測量氧氣濃度。Unisense微電極系統(tǒng)被安裝在三維顯微操縱器上，并連接到微電極主機系統(tǒng)上，使用SensorTrace Pro軟件進行控制。能夠獲得在發(fā)酵過程中實時監(jiān)測氧氣濃度的變化，更好地理解發(fā)酵過程中微生物的代謝活動和氧氣利用情況。

實驗結(jié)果

揭示了酒胚（發(fā)酵谷物）和窖泥在泥窖中由兩個空間相連的微生物生境組成，其環(huán)境條件顯著不同。宏基因組測序顯示，酒胚（發(fā)酵谷物）和窖泥中微生物群落的結(jié)構(gòu)在發(fā)酵過程中存在顯著差異。乳酸菌在九皮的微生物群中占主導(dǎo)地位，而梭狀芽胞桿菌是坑泥中的主要細(xì)菌，主要包括氫孢菌屬、Sedimentibacter和Caproiciproducens。酒窖原位發(fā)酵和體外實驗表明，乳酸和乙酸主要由九皮微生物群產(chǎn)生，棲息在窖泥中的微生物負(fù)責(zé)合成己酸和丁酸。這些是與濃郁風(fēng)味白酒相關(guān)的四種關(guān)鍵有機酸。這項研究表明，酒胚（發(fā)酵谷物）和窖泥中微生物群落內(nèi)的合作推動了白酒發(fā)酵過程中關(guān)鍵風(fēng)味化合物的形成。

圖1、人工奶酪樣品中，NaCl或水與奶酪混合后的滲透壓與水活性的關(guān)系。點表示觀察值的平均值，誤差條表示滲透壓的10次重復(fù)實驗和水活性的4次重復(fù)實驗的兩個標(biāo)準(zhǔn)差。

圖2、13.5°C下奶酪成熟過程中，奶酪表面微觀pH值的變化，A表示0.7厘米半徑的奶酪表面凸起處，B表示4.3厘米半徑的奶酪表面凹陷處。交叉點為觀察值（每個日期n=5），虛線表示建模的變異性區(qū)域的2.5%和97.5%分位數(shù)。

圖3、發(fā)酵谷物和窖泥微生物群落的β多樣性。酒窖聯(lián)盟的UPGMA聚類分析和PCoA分析。（A，C）細(xì)菌，（B，D）真菌

圖4、白酒發(fā)酵窖中不同微生物棲息地之間的細(xì)菌流動。（A）直方圖顯示了發(fā)酵谷物和窖泥樣品在發(fā)酵不同階段的共享OTU的相對豐度。（B）跟蹤酒平樣品在不同發(fā)酵階段共享OTU的Sankey圖（矩形的高度與OTU的數(shù)量相關(guān)）。（C）發(fā)酵谷物和窖泥中主要OTU的相對豐度動態(tài)。

圖5、觀察到的奶酪表面微觀水活性（aw）變異性，按表面和位置劃分。連接的點表示一個奶酪表面的累計分布函數(shù)（cdf），描述表面內(nèi)位置的變異性（s location）。連接點分布的離散性說明了奶酪間或表面間的變異性（s surface）。實線為一個表面的水活性中位數(shù)cdf，虛線顯示了建模的表面間變異性區(qū)域的2.5%和97.5%分位數(shù)。

結(jié)論與展望

泥窖長期以來一直被用作中式濃香白酒發(fā)酵的厭氧生物反應(yīng)器，其中淀粉原料（主要是高粱）被多物種微生物代謝成乙醇和各種風(fēng)味化合物。發(fā)酵谷物和坑泥是泥窖中兩個空間相關(guān)的微生物棲息地，但它們的代謝分工仍不清楚。在這里研究人員研究了發(fā)酵過程中發(fā)酵谷物和窖泥中環(huán)境變量（如溫度、氧氣、pH值）、關(guān)鍵代謝物（如乙醇、有機酸）和微生物群落的變化。酒胚（發(fā)酵谷物）（低pH值、高乙醇）和窖泥（中性pH值）為微生物生長提供了兩個環(huán)境條件截然不同的棲息地。乳酸在發(fā)酵谷物中積累，而丁酸和己酸主要由棲息在窖泥中的微生物產(chǎn)生。

利用實時定量PCR的生物量分析表明，細(xì)菌在發(fā)酵過程中占微生物群落的主導(dǎo)地位，此外聚類和主坐標(biāo)分析（PCoA）分析顯示酒胚和窖泥的細(xì)菌群落存在顯著差異。Unisense微電極系統(tǒng)被用于監(jiān)測發(fā)酵過程中酒胚和窖泥的氧氣含量變化，研究人員能夠在白酒發(fā)酵過程中實時監(jiān)測氧氣濃度的變化，從而更好地理解發(fā)酵過程中微生物的代謝活動和氧氣利用情況。酒胚中細(xì)菌群落多樣性在發(fā)酵過程中顯著降低，在窖泥中相對穩(wěn)定。乳酸菌屬在發(fā)酵谷物中菌群落中占主導(dǎo)地位，其相對豐度在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到98.0%。梭狀芽胞桿菌（相對豐度：42.9-85.5%）是窖泥中最豐富的細(xì)菌，主要分布在氫孢菌屬（5.3-68.4%）。發(fā)酵谷物和窖泥的真菌群落表現(xiàn)出相似的演替模式，其中Kazachstania、Aspergillus和Thermoascus是優(yōu)勢屬。PICRUSt分析表明，參與乙酸和乳酸生物合成的酶主要富集在九平樣品中，而窖泥中的細(xì)菌群落表現(xiàn)出更大的丁酸和己酸合成潛力。體外模擬發(fā)酵的分析進一步驗證了九平微生物群在乙酸和乳酸生產(chǎn)中的作用，這些酸隨后被坑泥微生物群代謝為丁酸和己酸。本研究工作證明了酒胚（發(fā)酵谷物）和坑泥微生物群落之間的協(xié)同合作，以形成濃郁風(fēng)味的白酒的代表性風(fēng)味。