近年來(lái)，隨著微納制造技術(shù)和傳感檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，以及細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，基于心肌細(xì)胞的無(wú)標(biāo)記、實(shí)時(shí)、非侵入性細(xì)胞檢測(cè)的生物傳感器的研究越來(lái)越受到人們的關(guān)注。微電極陣列（Microelectrode array，MEA）是一種用于檢測(cè)細(xì)胞電生理活動(dòng)的設(shè)備，它由多個(gè)微型電極組成，能夠同時(shí)記錄或刺激多個(gè)細(xì)胞的電信號(hào)。這些電極通常布置在一個(gè)基底上，形成陣列，用于研究神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)、心肌細(xì)胞等電生理特性。MEA技術(shù)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和生物工程領(lǐng)域，特別是在神經(jīng)科學(xué)研究和心臟病學(xué)研究中。

對(duì)心肌細(xì)胞電生理特性的有效檢測(cè)，能幫助研究者和臨床醫(yī)生更好的理解低血糖引發(fā)的各類(lèi)心臟疾病的致病機(jī)制和病程的發(fā)展。然而目前的體外細(xì)胞模型并不能實(shí)時(shí)準(zhǔn)確地反映心肌細(xì)胞在葡萄糖剝奪條件下的電生理變化，因此亟需開(kāi)發(fā)一種新的實(shí)驗(yàn)方法幫助相關(guān)科學(xué)研究的開(kāi)展。

摘要:本發(fā)明公開(kāi)了一種長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)檢測(cè)心肌細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法，包括：搭建基于微電極陣列的生物傳感系統(tǒng)、微電極陣列芯片的表面修飾、培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞、檢測(cè)心肌細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)：首先將微電極陣列芯片表面包被明膠；然后分離并提取原代心肌細(xì)胞，制備原代心肌細(xì)胞懸液并種植在微電極陣列芯片培養(yǎng)腔內(nèi)；最后將心肌細(xì)胞培養(yǎng)于不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，實(shí)時(shí)記錄心肌細(xì)胞胞外局部場(chǎng)電位信號(hào)的變化；提取電位信號(hào)的時(shí)域和頻域特征并進(jìn)行歸一化，得到該葡萄糖濃度條件下的濃度依賴(lài)響應(yīng)曲線。本發(fā)明利用心肌細(xì)胞自發(fā)放電的生理特性，結(jié)合微電極陣列芯片，實(shí)時(shí)記錄葡萄糖剝奪條件下心肌細(xì)胞的電生理變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)的檢測(cè)評(píng)價(jià)。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)裝置：

本發(fā)明提供的一種長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)檢測(cè)心肌細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)裝置，包括細(xì)胞電生理傳感裝置、信號(hào)采集器、信號(hào)放大器、計(jì)算機(jī)和細(xì)胞培養(yǎng)箱。其中，細(xì)胞電生理傳感裝置為現(xiàn)有公開(kāi)文獻(xiàn)記載的技術(shù)，包括中空玻璃培養(yǎng)腔、微電極陣列芯片和印刷電路板（Printed Circuit Board，PCB）適配器；該傳感裝置的結(jié)構(gòu)和加工方法具體可參考專(zhuān)利申請(qǐng)公開(kāi)文獻(xiàn)CN115078466A。信號(hào)采集器通過(guò)長(zhǎng)屏蔽電纜連接信號(hào)放大器，信號(hào)放大器由數(shù)據(jù)連接線與計(jì)算機(jī)連接。細(xì)胞電生理傳感裝置插入信號(hào)采集器后，可放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的心肌細(xì)胞電生理信號(hào)采集。

進(jìn)一步地，將信號(hào)采集器與信號(hào)放大器分別置于兩個(gè)獨(dú)立的金屬盒內(nèi)，以減小體積，由此可將傳感裝置放置在培養(yǎng)箱內(nèi)以保持心肌細(xì)胞的活力，實(shí)現(xiàn)對(duì)電生理信號(hào)的長(zhǎng)時(shí)間、連續(xù)監(jiān)測(cè)；將另一個(gè)金屬盒放置于培養(yǎng)箱外部以方便操作。

進(jìn)一步地，微電極陣列芯片插槽外部加裝金屬蓋，以屏蔽外部信號(hào)干擾，提高信噪比。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明實(shí)施例中葡萄糖剝奪前后心肌細(xì)胞電生理信號(hào)變化圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例中葡萄糖剝奪前后心肌細(xì)胞電生理信號(hào)特征參數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；其中，圖2中的（A）為無(wú)糖組、葡萄糖組、對(duì)照組的細(xì)胞幅值與時(shí)間關(guān)系的曲線圖；圖2中的（B）為無(wú)糖組、葡萄糖組、對(duì)照組在連續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)過(guò)程中心肌細(xì)胞的放電頻率與時(shí)間關(guān)系的曲線圖；

圖3是本發(fā)明實(shí)施例中葡萄糖剝奪同時(shí)抑制細(xì)胞自噬的心肌細(xì)胞電生理信號(hào)變化圖；

圖4是本發(fā)明實(shí)施例中葡萄糖剝奪同時(shí)抑制細(xì)胞自噬的心肌細(xì)胞電生理信號(hào)特征參數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；其中，圖4中的（A）為24小時(shí)連續(xù)監(jiān)測(cè)細(xì)胞自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）處理葡萄糖饑餓心肌細(xì)胞的歸一化幅值變化曲線圖；圖4中的（B）為葡萄糖饑餓條件下3-MA對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)放頻率的影響曲線圖。

一種長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)檢測(cè)心肌細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法，其特征在于，包括以下步驟：（1）搭建基于微電極陣列的生物傳感系統(tǒng)：將信號(hào)采集器、信號(hào)放大器和計(jì)算機(jī)進(jìn)行連接；所述信號(hào)采集器用于采集和記錄電生理信號(hào)，所述信號(hào)放大器用于放大電生理信號(hào)；將微電極陣列芯片插入信號(hào)采集器，并放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中；（2）微電極陣列芯片的表面修飾：將微電極陣列芯片表面包被明膠，用于增強(qiáng)心肌細(xì)胞在微電極陣列芯片表面的粘附程度；（3）培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞：分離并提取原代心肌細(xì)胞，制備原代心肌細(xì)胞懸液，并將原代心肌細(xì)胞懸液種植在微電極陣列芯片培養(yǎng)腔內(nèi)，心肌細(xì)胞均勻分布于微電極陣列芯片表面；（4）檢測(cè)心肌細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)：將心肌細(xì)胞培養(yǎng)于不同葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中，實(shí)時(shí)記錄微電極陣列芯片上的心肌細(xì)胞胞外局部場(chǎng)電位信號(hào)的變化；提取所檢測(cè)到的電位信號(hào)的時(shí)域和頻域特征，并進(jìn)行歸一化處理，得到該葡萄糖濃度條件下的濃度依賴(lài)響應(yīng)曲線，根據(jù)曲線體現(xiàn)的電位信號(hào)衰減趨勢(shì)判斷不同程度的葡萄糖剝奪所導(dǎo)致的能量應(yīng)激狀態(tài)。

本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明利用心肌細(xì)胞自發(fā)放電的生理特性，結(jié)合微電極陣列芯片，通過(guò)簡(jiǎn)單、高效的方法實(shí)時(shí)快速地記錄葡萄糖剝奪條件下心肌細(xì)胞的電生理變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)的檢測(cè)評(píng)價(jià)，且為理解低血糖對(duì)心臟的影響提供了新的工具，對(duì)糖尿病和低血糖癥的藥物篩選和臨床研究具有重要價(jià)值。